阿尔茨海默病唾液标志物机器翻译
阿尔茨海默病唾液标志物的诊断效能：一项系统评价
Priscilla Vendramini Borelli, Leonardo Machado, Giovanna Carello-Collar,Pamela C. L. Ferreira, Amanda Muliterno Domingues Lourenço de Lima,Bruna Bellaver, Tharick Ali Pascoal, Andrea L. Benedet, Nicholas J. Ashton,Eduardo R Zimmer, Wyllians Vendramini Borelli
已有研究报道阿尔茨海默病（AD）唾液标志物的诊断准确性存在高度异质性，但其原因尚不明确。本系统评价旨在评估AD唾液生物标志物诊断效能异质性的潜在来源。我们系统检索了4个数据库自建库至2025年发表的相关研究，评估了生物标志物的灵敏度、特异度及曲线下面积（area under the curve，AUC）。本研究严格遵循系统评价与Meta分析优先报告条目（PRISMA）声明开展。在3118项研究中，18项符合纳入标准。仅β淀粉样蛋白（Aβ）42与乳铁蛋白存在可用的AUC数据。分析前处理流程是导致异质性的主要来源，包括采样前指导、采样时间、采样管材质及离心方法。研究间结果变异的核心原因大概率源于分析前处理流程的显著差异。未来亟需开展采用标准化方案的AD唾液生物标志物研究。
关键词：β淀粉样蛋白；分析流程；生物体液；生物标志物；诊断；乳铁蛋白；文献综述；分析前处理流程；磷酸化tau蛋白；唾液；系统评价；tau蛋白
- 既往Meta分析显示，乳铁蛋白可区分认知正常者（cognitive Unimpairment，CU）与阿尔茨海默病患者
- 各项研究的分析前处理方法差异极大
- AD唾液标志物在区分CU与AD时表现出显著异质性
- 无任何一项研究完全符合唾液采样、处理与分析的指南规范
- 未来研究应依据标准化方案统一实验流程
阿尔茨海默病是影响老年人群最常见的神经退行性疾病¹。AD的早期诊断有助于及时干预与管理，有望降低治疗成本，并延缓或改变疾病进程。AD核心生物标志物因在检测疾病核心病理改变（如Aβ沉积与tau神经原纤维缠结）方面具备高灵敏度与高特异度，已被纳入临床实践，即便在疾病临床前期也可实现检测。在疾病早期阶段识别这些AD相关病理改变，对于指导旨在改变AD病程的疾病修饰疗法研发至关重要。
临床中，正电子发射断层显像（PET）与脑脊液（CSF）检测是评估患者AD病理改变的金标准方法²。然而，基于PET与CSF结果的AD生物标志物辅助诊断在临床转化中面临诸多障碍。这些挑战与检查费用高昂相关，公共卫生系统通常难以承担。此外，并非所有患者均适合接受腰椎穿刺或影像学检查，这凸显了血液生物标志物等更易获取检测手段的重要性。事实上，美国食品药品监督管理局（FDA）近期已批准一项AD诊断血液检测，该检测在科研与临床场景中均展现出识别Aβ病理改变的高准确性³⁻⁴。资源有限的国家（尤其是全球南方地区）在AD诊断技术进展中往往处于滞后状态，凸显了研发新型、更易获取诊断方法的迫切需求。为提升检测可及性，近年来血液生物标志物得到广泛探索，并在科研⁵与临床⁶⁻⁸场景中均展现出识别Aβ阳性状态的高准确性。
近期证据提示，唾液可作为检测AD相关生物标志物的替代生物基质。相较于血液，唾液采集具备无创、操作无应激、可重复采样等多重优势⁹。唾液是易获取的体液，其成分可在多种病理生理状态下发生改变¹⁰。唾液的临床应用价值已在口腔癌¹¹、严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARSCoV2）感染诊断及药物检测中得到证实¹²。唾液样本中生物标志物的检测与定量在科研、临床应用以及用于AD早期诊断与持续监测的无创生物标志物研发领域极具吸引力。然而，相较于血液、CSF等更稳定的生物基质，唾液易受多种因素影响而发生显著变异，如老年患者的合并症与唾液分泌减少。唾液成分生成需经过两步滤过：从脑组织进入血液，再从血液进入唾液。事实上，近期一项研究同时检测了AD核心生物标志物在唾液、血浆与CSF中的水平，结果显示唾液标志物与其他体液标志物无相关性¹³。在AD研究领域，近期以唾液为生物基质的生物标志物研究结果相互矛盾，引发了关于其临床应用价值的争议。尽管既往Meta分析也评估了诊断效能，但仍存在关键研究缺口：其结果异质性的根本原因未被充分阐释。本研究在既往工作基础上，评估了AD唾液生物标志物诊断效能异质性的潜在分析前与分析中来源。本系统评价可为未来唾液生物标志物实验方案的标准化提供实践指南。
2 研究方法
2.1 检索策略与纳入排除标准
本研究方案已在开放科学框架（OSF）注册（注册号：fve4u）¹⁴。本系统评价依据系统评价与Meta分析优先报告条目（PRISMA）声明指南，检索自建库至2025年1月发表的文献。检索数据库包括Embase、PubMed、Scopus与Web of Science。检索式采用布尔逻辑运算符，结合以下关键词：阿尔茨海默病、唾液及相关术语（表S1）。
由两名研究者（P.V.B.与L.M.）独立依据标题、摘要与全文筛选文献，意见不一致时由第三位评审人（W.V.B.）裁决。纳入本评价的研究需满足所有合格标准（表S2）。入选研究为以任意语言发表、探讨唾液中AD生物标志物的原创性全文论著；同时手动检索灰色文献。
排除标准如下：（1）未依据国际指南¹⁵⁻¹⁸明确划分认知正常（CU）人群、AD源性轻度认知障碍（MCI）或AD源性痴呆人群的研究；（2）样本量＜10例的研究；（3）唾液生物标志物浓度数据未以均值（标准差，SD）或中位数（四分位距，IQR）形式呈现的研究；（4）采用非定量方法评估生物标志物结果的研究；（5）研究对象年龄＜18岁的研究；（6）研究方法未恰当标注参考文献的研究。
2.2 数据分析与质量评价
两名作者（P.V.B.与W.V.B.）依据数据提取表，从符合合格标准的研究中提取数据，包括生物标志物信息、CU与AD人群的年龄与性别、纳入排除标准、诊断标准、分析方法、诊断效能、所评估生物标志物的曲线下面积（AUC）、灵敏度与特异度。对于数据不完整或缺失的研究，通过邮件联系通讯作者获取补充信息（每项研究尝试联系2次）。数据来源于横断面研究、队列研究及纵向研究的基线测量值与临床随访数据。两名研究者（P.V.B.与W.V.B.）核对所有提取数据的准确性。采用纽卡斯尔渥太华量表（NOS，表S3）评估纳入研究的方法学质量，分值范围0~9分¹⁹。
2.3 唾液生物标志物诊断效能评价
我们系统评估分析前处理方法，明确唾液采样前指导、采样时间、采样方式、采样管材质、离心流程与储存条件。对分析前处理方法进行定性评估，明确纳入研究所用方法的一致性与差异性。同时依据各项研究报道的技术平台评估分析方法。
3 研究结果
初始数据库检索共获得3118篇文献，去除重复文献后剩余2505篇（图1）。18项研究符合本系统评价的纳入标准。纳入研究发表于2010—2025年，数据来自12个国家，其中欧洲地区研究占比最高（11/18，61.1%）。纳入研究共包含726例CU人群、361例MCI患者与668例AD痴呆患者。纳入CU人群的研究样本量为10~160例，MCI为15~68例，AD为11~80例。表1总结了本系统评价纳入研究的提取数据。总体而言，多数研究偏倚风险不明确/质量中等，NOS评分为5~6分（表S3）。
18项研究评估了唾液标志物的诊断效能，共涉及47种不同唾液生物标志物（表2）。其中5项研究开展了蛋白质组学与代谢组学分析²⁰⁻²⁴。6项研究（33.3%）检测唾液Aβ42水平，4项研究（22.2%）评估乳铁蛋白与磷酸化tau蛋白（ptau），3项研究（16.6%）检测总tau蛋白（ttau），2项研究（11.1%）检测ptau/ttau比值。此外，6项研究探讨了腺苷脱氨酶（ADA）、胆碱酯酶（ChE）²⁵、拉曼光谱²⁶、微小RNA（miRNA）²²等其他标志物。
纳入研究中不同唾液生物标志物的诊断效能结果差异显著。3种唾液标志物（胶质纤维酸性蛋白[GFAP]、拉曼光谱、乳铁蛋白）区分CU与AD的AUC达到或高于0.99（表2）²¹,²⁶,²⁷。另有5项研究未发现唾液标志物区分AD的统计学差异（表2）²⁰,²⁵,²⁸⁻³⁰。Aβ42、乳铁蛋白与ptau的研究结果存在分歧（表2）³¹,³²。由于诊断效能数据不完整（如缺乏AUC、灵敏度或特异度）或其他标志物的相关研究数量不足，无法开展Meta分析（补充表4）。
我们同时评估了唾液标志物区分MCI与其他人群（CU与AD）的诊断准确性，结果同样不一致。一项研究报道CU人群唾液乳铁蛋白水平高于MCI患者，而MCIPET阳性患者与AD患者水平相近⁴⁰。单项研究发现唾液GFAP²²、角质素蛋白stratifin³⁶、拉曼光谱²⁷存在异常改变。相反，3项研究未发现CU与MCI组间存在显著差异⁵,²¹,³¹。
为明确结果变异的潜在来源，我们评估了每项研究的分析前处理流程参数（图2）。多数研究（15项，83.3%）报告了采样前指导，包括采样前禁烟、清洁口腔、禁食禁饮、遵循特定饮食、采样前清水漱口或空腹⁵,²⁰⁻²¹,²⁵⁻²⁶,²⁸⁻³⁴（表3）。关于采样管类型，5项研究（27.7%）使用无添加液聚丙烯管，4项（22.2%）使用含叠氮钠溶液聚丙烯管，1项使用RNA ProSAL试剂盒，1项使用吸收垫，1项使用磷酸盐缓冲液（PBS），1项使用预称重无菌塑料容器，5项未明确采样管材质。关于采样时间，12项研究（66.6%）报告在固定时间采样，其中6项上午采样、3项下午采样、3项上午/中午采样。共报道14种不同离心方法（表3），仅3项采用相同参数（600 g，4℃，10 min），1项未离心³⁵。最常用采样方式为静息唾液采样（12项，66.6%），3项（16.7%）采用刺激采样，1项（5.6%）同时采用静息与刺激采样，2项未报告唾液采样方式²⁶,²⁸。仅9项研究（52.9%）报告样本采集后立即置于冰上。16项研究（88.9%）报告样本储存于80℃，1项（5.6%）储存于20℃，1项（5.6%）未报告储存方式。仅1项研究明确采集唾液的腺体来源³⁴。
分析流程方面，酶联免疫吸附试验（ELISA）应用最广泛（11项研究，64.7%），其中8项仅采用ELISA，3项联合其他方法（如印迹法²¹与蛋白质组学平台³⁵⁻³⁶）。2项研究（11.7%）采用单分子阵列技术（Simoa），3项（16.6%）采用质谱联合其他方法的蛋白质组学平台，2项（11.7%）采用拉曼光谱²⁶、实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）²²等其他方法。
本系统评价评估了AD唾液生物标志物的诊断效能，并探讨了分析前与分析中特性导致异质性的潜在来源。已有研究报道唾液乳铁蛋白与Aβ42可区分CU与AD人群。既往Meta分析显示唾液乳铁蛋白与Aβ42具备足够诊断效能，但未评估分析前处理流程³⁷⁻³⁸。
各项研究的分析前处理流程差异极大。具体而言，我们发现样本采集与处理存在显著异质性：（1）唾液采样前空腹似乎可提升诊断准确性²³⁻²⁴,²⁶⁻²⁷,³⁵；（2）静息唾液采样同样与高诊断效能相关²¹,²⁴,²⁷；（3）多数诊断效能优异的研究采用80℃储存样本²⁰⁻²⁵,²⁷⁻³³,³⁵⁻³⁶,³⁹。相比之下，采样时间、采样管材质与离心流程似乎与诊断效能无关。值得注意的是，本评价纳入研究均未报道或未使用低吸附管，而该材质已知会影响Aβ水平⁴⁰。5项未能区分AD与CU的研究存在分析前处理差异：1项乳铁蛋白研究（刺激采样）、1项Aβ42研究（未空腹）、1项ttau研究（500 g，4℃离心）、1项神经丝轻链（NfL）研究（未空腹）²⁰,²⁵,²⁸⁻³⁰。总体而言，本研究结果提示唾液生物标志物的诊断效能高度受分析前处理流程影响，具体包括采样前指导、采样时间、采样管材质与离心方法。事实上，分析前处理流程的变异一直被认为是AD生物标志物研究偏倚的主要来源¹³,⁴¹⁻⁴²。尤其是GFAP、ptau亚型等极低浓度分析物，极易受分析前变异影响⁴²。
若缺乏严格的标准化，结果变异将持续阻碍研究进展，限制AD及其他神经系统疾病可靠唾液生物标志物的研发。
用于检测AD唾液生物标志物水平的分析方法种类繁多。具体而言，多种分析方法均报道了良好的准确性，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）²¹,²⁷,³⁴,³⁶,³⁹、质谱²³⁻²⁴与高光谱成像²⁶。值得关注的是，采用超灵敏技术平台检测唾液ttau²⁹、ptau与NfL²⁰的研究，未发现区分CU与AD的统计学差异。需注意，唾液标志物区分CU与MCI的诊断效能结果不一致。有观点认为ttau并非理想标志物，而ptau或NfL的结果受限于唾液中检测方法未经验证。另一种可能的解释是前述检测方法准确性较低⁴³⁻⁴⁴。由于研究对象为低丰度分析物，未来研究应聚焦采用超灵敏技术评估唾液生物标志物的诊断效能。解读唾液生物标志物结果时，还需考虑混杂因素，如饮酒史与唐氏综合征对唾液乳铁蛋白水平的影响⁴⁵⁻⁴⁶。
最后，痴呆研究唾液生物标志物工作组已发布AD唾液生物标志物分析前变量标准化指南，这是迈向分析前与分析中流程统一的重要第一步⁴⁷。实施唾液采集标准化方案以评估AD生物标志物，对于推动其诊断效能研究至关重要，但若无高性能生物标志物作为参照，方案优化难度较大。例如，自主采样会引入不可控的分析前变异，而刺激与静息唾液的差异进一步增加了标准化难度。目前已提出唾液采样、储存与分析的最优方案。令人关注的是，纳入研究无一完全符合该推荐方案，方案推荐内容包括：（1）2500×g，4℃，离心15 min；（2）采样前空腹并漱口；（3）不使用棉材质采样。上述结果提示，诊断效能的变异可能源于多项分析前处理流程的差异。
尽管我们努力整合各项研究数据，但仍存在明显局限性。各项研究的方法学异质性为本研究带来挑战，且我们可能仅纳入了报道AUC阳性结果的研究。尽管诊断标准为纳入标准，但AD诊断标准随时间发生显著变化，诊断异质性仍可能存在。所检测的AD生物标志物多为血液或CSF验证标志物，但未在唾液中完成验证。评估唾液生物标志物时还需考虑样本量因素，尽管我们已通过仅纳入每组样本量≥10例的研究尽量降低该影响。此外，唾液生物标志物研究中低收入与中等收入国家代表性不足，限制了研究结果的外推性，尤其是全球适用性。
综上，AD唾液生物标志物研究的分析前与分析中异质性，是明确唾液标志物临床应用价值的主要障碍。样本采集与处理方法的变异、分析技术的多样化，增加了生物标志物比较的难度，凸显了实施标准化操作流程的必要性。未来研究应聚焦制定与采用这些标准化方法，为唾液生物标志物在AD诊断中的应用提供稳定、可靠的证据。
图表注释汇总
图1 （A）系统评价与Meta分析优先报告条目（PRISMA）纳入研究流程图；（B）全球检索研究分布情况。AD，阿尔茨海默病。
表1 本系统评价纳入研究汇总
