中药化学分子研究：甘草次酸与Warburg效应机器翻译
中药的科学研究，是中药发展的必由之路。
但研究中药却不是我实验室的必然工作。我们实际上没有计划做中药的研究。
我做过屠呦呦和青蒿素的科学史，但那是与北大医学部人物学部的张大庆和他的研究生黎润红的合作，与我的实验室无关。
我在北大的实验室，突然研究中药的单体化学分子，完全是误打误撞。我是安排的实验室多个研究生（北大都是直博生，我和一公回国后，北大清华的生命科学已经多年没有硕士生了）筛选一些分子及其作用。朱晨用的一个小分子库，是从国外购买的，发现有作用的分子里面，居然有一个是中药甘草来源的单体化合物甘草次酸（18β-GA）。朱晨观察到某种作用后，因为她还有其他重要观察，所以我请她专注那个课题，她有重要发现（且听明年分解）。我请夏冰心接朱晨的初步发现，研究18β-GA的机理。
18β-GA有抗癌作用，是其他多个研究课题组已经发现并报道的。但它的作用需要什么，并不清楚。
夏冰心用体外培养细胞系可以观察到18β-GA的杀癌细胞作用。这是验证其他人的发现。我安排她去北大魏文胜实验室学习分子生物学筛选方法（CRISPRi），用CRISPR的方法筛选可以抑制18β-GA作用的基因。她学的很快(也说明魏老师实验室的技术特别好，魏老师及其实验室的同事热心教我们）。很快掌握了技术，而且探索不同的检测可能。第一个检测拿不到很可靠的结果，换了第二个方法：看细胞死还是不死。魏老师也说过，用死亡来筛选最有效，我们验证了魏老师的建议。
用18β-GA孵育癌细胞，可以杀死癌细胞。而如果用CRISPRi方法筛选很多sgRNA的时候，有些sgRNA可以阻止18β-GA杀癌细胞的作用。我们把这些sgRNA拿出来，基因测序，然后多次同样筛选，几次都能富集的sgRNA就可能是对于18β-GA杀癌细胞所必需的基因。
我们拿到了多个基因，而且多个可以被反复验证。
在这些基因里面，有两个很有趣：它们有相关性。一个基因编码转运乳酸的蛋白质（学名：乳酸转运体，MCT1）。一个基因编码的蛋白质辅助MCT1。那么这就有趣了。
这时，我们学习文献。
在癌症领域，有一个著名的Warburg效应。这是1923年德国科学家、诺奖得主Otto Warburg发现的。通常，细胞在氧气充足的情况下，进行氧化磷酸化，缺氧的情况下进行糖酵解。Warburg发现，癌细胞氧化磷酸化减少，糖酵解增加。这一效应很快被另外一对诺奖得主所重复，Getty Cori和Carl Cori夫妇马上将这一效应命名为Warburg效应。
后来的研究证明，癌细胞在有氧的情况下，增加了糖酵解，但没有减少氧化磷酸化。所以，Warburg效应的正确表述是：癌细胞在有氧情况下增加糖酵解。
糖酵解是所有学习生物化学的学生都被要求死记硬背的一条通路。我实验室每一个学生都曾经被折磨过。一般难以记住其中的细节，容易记住所谓产生了多少个ATP。但糖酵解很简单的一个结果是：乳酸增加。因为乳酸是糖酵解的必然产物。
癌细胞的糖酵解增加，导致乳酸增加。如果乳酸太多，癌细胞就会被自己酸死。所以，很多癌细胞就通过增加MCT1的表达，把乳酸转运出去。
这就有趣了，癌细胞增加糖酵解，糖酵解增加乳酸，如果癌细胞要避免自杀，就要增加MCT1。
文献读到这里，就太有趣了。我们的发现，意味着甘草次酸可以通过MCT1而进入癌细胞，从而杀死癌细胞。
有了这一假设，夏冰心就做了一系列实验，证明甘草次酸确实是通过MCT1而转运进入癌细胞，从而杀死癌细胞。
这一研究非常有趣，对研究生是很好的科学和技术训练。有偶然，有文献学习，有思考，有技术，有严格的实验。
筛选带来的是惊讶，而不是事先知道结果。实际上，事先只设计了一步实验，后面的实验是根据前面的实验结果而一步一步设计。
像是一个侦探故事。
研究生是侦探，人类对自然的侦探。
这一研究也可以有意义，意义的大小需要时间检验。
一个可能比较大的意义是：甘草次酸的机理，等于是特异针对癌细胞，针对Warburg效应而杀细胞，那就是杀癌细胞。
这一机理提示可以用甘草次酸，或者它的衍生物，或者按这一机理设计其他抗癌药物，增加对癌细胞的特异性，减少副作用。
目前的缺点是：1）MCT1并非甘草次酸杀癌细胞的靶蛋白，只是让甘草次酸进入细胞，靶蛋白应该是其他；2）甘草次酸（18β-GA）本身的抗癌作用不是很强，所以用它不够。
但是，如果改变它的结构，增加抗癌作用，保留特异性，可能就很好。不改变它，而改变一个已知的强效抗癌药，但接上可以通过MCT1的基团，针对Warburg效应，也是一种方法。
还有一种可能，很毒的药物，因为缺乏特异性而副作用很大，但如果接上特定结构，有如甘草次酸的结构，从而专门进入MCT1，可能也可以特异针对癌细胞。
所以，一个研究不仅在于它本身有趣，还在于可以刺激更多的研究和设计】
靶向Warburg效应：乳酸转运蛋白MCT1及其分子伴侣在18β-甘草次酸杀伤癌细胞中的作用
夏冰心 朱晨 饶毅
Warburg效应癌症转运蛋白中草药
甘草是一种常用的中药，其主要成分是甘草酸，衍生产品18β-甘草次酸（18β-GA）具有抗肿瘤活性。本研究通过全基因组CRISPR筛选，确定了18β-GA敏感性所需的基因。我们发现乳酸转运蛋白MCT1及其膜分子伴侣BSG参与了18β-GA对癌细胞的杀伤作用。MCT1对于癌细胞摄取18β-GA是必要且充分的。BSG对于MCT1在细胞膜上的定位是必需的，因此对于18β-GA的摄取以及癌细胞的死亡至关重要。虽然已知癌症的Warburg效应会增加乳酸产生，进而选择更高表达MCT1的癌细胞，通过排出乳酸来增强癌细胞的存活，但我们的研究揭示了一个新的机会，即通过Warburg效应增加癌细胞对18β-GA的敏感性，从而杀死癌细胞。因此，我们的结果揭示了18β-GA敏感性的生物标志物，并暗示了利用Warburg效应使药物进入肿瘤细胞的可能性，这将激发对传统中药的进一步分子机制研究和改进。
1. 引言
在现代医学传入中国之前，传统中药已经为中国保驾护航数千年。其中最常用的中药之一是甘草（Glycyrrhiza glabra），它有着悠久的历史[1,2]。从其根部提取的主要化学物质是甘草酸，经肠道细菌水解后产生18β-甘草次酸（18β-GA）[3,4]。
癌症仍然是全球健康的重大挑战，传统治疗方法常常受到药物耐受性和不良反应的限制。癌症细胞代谢的一个标志是由Otto Warburg在一百年前发现的[5-7]，并很快由Carl和Getty Coris证实[[8-12]。最初认为糖酵解增加而氧化磷酸化减少，但后来的共识是癌症细胞在有氧条件下仅增加糖酵解（“有氧糖酵解”），产生更多的乳酸[5-7,10,11]。
发现新型治疗剂和分子靶点对于推进癌症治疗至关重要。一些值得注意的抗癌药物是从植物中发现的，例如紫杉醇和长春碱，它们最终成为卵巢癌等常见癌症的一线治疗选择[13]。18β-GA已被发现具有抗癌效果[14,15]，对多种癌细胞表现出广谱活性[16-19]。18β-GA可以抑制对癌症生长和转移至关重要的主要途径，例如PI3K/Akt、MAPK/ERK1/2和Akt/mTORC1/STAT3[14,17,20,21]。尽管对18β-GA的抗癌机制有很多研究，但关于允许18β-GA进入细胞的细胞膜分子基础知之甚少[22-24]。
CRISPR-Cas9提供了一种强大的基因修饰技术[25]，衍生技术是应用CRISPR-Cas9进行基因功能筛选[26-30]。它可以用来寻找药物敏感性和耐药性的机制[29,31,32]。
在这项研究中，我们应用基于CRISPR-Cas9的筛选系统地寻找18β-GA反应所需的基因。我们发现单羧酸转运蛋白1（MCT1，也称为SLC16A1）及其膜分子伴侣basigin（BSG）是18β-GA敏感性所需的。
溶质载体（SLC）有助于细胞质和囊泡转运体。家族16（SLC16）在人类中有14个成员，它们是依赖于电化学Na+或H+梯度的次级主动转运体[33-36]。MCT1是SLC16家族的成员，是一种质子偶联的单羧酸转运蛋白，负责转运乳酸和丙酮酸等单羧酸[37-41]。BSG是MCTs的分子伴侣，对于MCT1、MCT3和MCT4在细胞膜上的定位至关重要[42-47]。在癌症中发现了MCT1的过表达[36,48-56]。MCT1允许乳酸从正在进行有氧糖酵解的癌症中运出，这对于癌症细胞代谢至关重要。先前针对癌症细胞Warburg效应的策略是通过化学化合物抑制MCT1[57-60]。由于乳酸很小，因此并不明显可以将有毒分子标记到通过MCT1的分子上。
我们的进一步研究表明，18β-GA依赖于MCT1被运输到癌细胞中，MCT1的高表达使细胞对18β-GA更敏感，从而表明像18β-GA这样比乳酸大得多的分子可以通过MCT1运输，因而可利用Warburg效应靶向癌细胞，为癌症治疗提供了新的策略。
2. 材料与方法
2.1 细胞培养试剂和抗体
H1975和A375细胞系由北京大学的魏文胜博士赠予。A375细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。H1975细胞在Roswell Park纪念研究所（RPMI）1640培养基中培养。所有细胞均补充10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素，在37°C、5%CO2的湿润培养箱中培养。
DMEM、RPMI 1640、胰蛋白酶和FBS购自Life Technologies/Gibco Laboratories（纽约州格兰德岛，美国）。Lipofectamine 3000（Invitrogen）。18β-GA和AZD3965购自MedChemExpress（MCE）（中国上海），溶于DMSO。
2.2 细胞活性测定
将细胞以104个/孔的密度接种在96孔板中过夜，然后用18β-GA在特定浓度下处理24或48小时（h）。处理后，使用CellTiter-Glo（Promega）、CCK-8（Abcam）和LDH细胞毒性检测试剂盒（Beyotime）测量每种浓度的细胞死亡百分比，与DMSO处理的细胞相比。
2.3 慢病毒包装质粒文库和感染
对于慢病毒生产，转染前一天将HEK293T细胞在五个10厘米培养皿中以大约40%的密度铺板。在转染当天，将含有12 μg质粒DNA（4 μg质粒文库：4 μg psPAX2：4 μg pMD2.G）的混合物准备在500 μL预温的Opti-MEM培养基中。然后将该混合物与Lipofectamine 3000在额外的500 μL Opti-MEM培养基中混合。在室温下孵育30分钟后，将转染混合物逐滴加入HEK293T细胞中。转染后48小时收获病毒上清液，通过0.45 μm Acrodisc注射器过滤器过滤，分装，并在-80°C下储存以供后续使用。为了确定感染复数（MOI），将目标细胞以5×106个/孔的密度接种在六孔板中，并用不同体积的病毒上清液补充8 μg/ml聚布雷纳（Millipore，#TR-1003-G）在新鲜培养基中感染24小时。随后，将感染的细胞转移到15厘米培养皿中，并用2 μg/mL的嘌呤霉素进行选择。
