对睡眠论文9个问题的回复

这是文章《Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II α and β differentially regulate mammalian sleep》的第一作者，代表本文所有作者，对Pubpeer上对本文提出的9点评论或质疑做出回应。

在做正式回应之前，我想先说明一下这篇文章的主要内容和发表理由。这篇文章的主要目的是展示一个阴性结果，也就是Camk2b敲除鼠没有NREM睡眠表型。这个结果与日本研究者Ueda, H. R.课题组声称的该基因敲除后NREM下降近2h的结果相悖1,2。我们在Communications Biology发表该结果，希望领域能够认真审视这个基因是否真的参与小鼠基础睡眠调控。

以下是针对这9条评论的具体回应：

一、关于Western blot 灰度值中部分小数尾数重复的问题（#1–3）

评论者注意到Figure 1C、1D 和Figure 2G 的部分Western blot灰度值数值具有相同的小数尾数，并据此认为这些数值“统计上异常”。

这些数值来自图像灰度定量过程，Western blot 定量值受图像灰度、ROI、像素数量、背景扣除以及软件计算和输出精度等因素共同影响。判断这些结果是否可靠，应当回到原始胶图，而不能仅依据数值末位模式进行判断。

回到质疑本身，本文所用的ImageJ灰度值定量方法，的确会产生相同尾数。在视频网站搜索同款定量方法教学视频时，可以看到，视频中按标准流程分析不同膜时，ImageJ 独立导出了多个小数尾数完全一致的灰度值（图1）。

图1 在视频网站找到的教学视频中，尾数.823以及.359在不同的条带中反复出现【研途指南：ImageJ 测量western blot（WB）条带灰度值】https://www.bilibili.com/video/BV13y4y1h76s/?share_source=copy_web&vd_source=3dd48bd1f3a817a3c77a865b76ce6a17。

我们又随机找了一篇文献3随机选取了一张图用同样方法计算灰度值，也出现了大量的尾数重复现象（图2）。

图2 一篇随机文献中的胶图Fig. 4E进行计算，反复出现大量相同尾数.042, .627, .749等。

我们去检索展示了类似数据的期刊，发现一些文章对于灰度值的原始数据仅上传normalized 后用于作图的ratio，而非ImageJ 直接导出的灰度值数据4-7；一些文章是只放了未裁膜的胶，而未展示计算过程8-12。最终我们还是找到了和我们存在类似数据类型的文章13（图3）。

图3 此文章的灰度值尾数也存在高度相似的情况。同颜色标注为同样尾数。

回到本文，我们不仅放了未裁膜的胶，并且把软件直接输出的灰度值也放进了source data，并且没有四舍五入而是选择保留所有有效数字，相信我们所提供的数据量已经满足了学术发表对于WB原始数据的要求。

二、关于Supplementary Figure S2 中Wake episode number 和NREM episode number 高度相似的问题（#4、#5、#6、#8）

部分评论将Figure S2A 与S2E，以及Figure S2C 与S2G 中dark phase 的数据进行了逐一比较，并把很多数值“完全相同”或仅相差1–2 次视为异常。这里需要说明的是，Wake episode number 和NREM episode number 并不是两个彼此独立产生的数据集。它们均来自同一只动物、同一段EEG/EMG 睡眠记录的状态序列。在连续的睡眠—觉醒状态序列中，一个Wake episode 的结束通常对应一个NREM episode 的开始，反之亦然。因此，在一定时间窗口内，Wake episode number 和NREM episode number 在数学上本来就高度耦合。

举例而言，在一个简单的Wake → NREM → REM → Wake → NREM → Wake状态序列中，Wake episode 和NREM episode 的数量天然只相差0 或1。实际动物睡眠还包含REM 状态，其中低频率发生的REM → NREM转换以及罕见发生的Wake → REM转换会导致差值略有变化，但两者高度接近是睡眠状态转换结构的自然结果，而不是两个“独立实验数据异常相似”。因此，评论中所强调的“相同”“相差1”“相差2”的规律，本身并不能作为数据异常的证据。

同样地，我们找到了一些和我们统计了相同指标的文章，虽然它们有些没有提供原始数据，但从柱状图以及数据点对应的趋势来讲，与我们的结果是相似的。

文章1：Effects of Social Defeat Stress on Sleep in Mice14（图4）

图4 本文Table 1中列出的number of bouts （等同于本文Episode number）在Wake和NREMS baseline完全一致。

文章2：Early-life sleep disruption in Shank3-deficient rats: A preclinical model for autism-related sleep mechanisms and interventions15（图5）

图5本文Figure 4B呈现数据中night的NREM bouts number和wake bouts number数量相近，原始数据多有相差1、相差2以及完全相等的情况（标黄数据部分）。

文章3：Chemogenetic activation of astrocytes modulates sleep–wakefulness states in a brain region-dependent manner16（图6）

图6 这篇文章没有给出原始数据，但是看Figure2 F和J图数据点分布的pattern和大致对应的数值是几乎一致的。

文章4 ：Anterior Insula Regulates Multiscale Temporal Organization of Sleep and Wake Activity17（图7）

图7 这篇文章没有给出数据点，但是Figure2 D图和E图的无论是24h、Dark还是light的平均值与误差棒是几乎一致的。

同样地，在文章5: Octacosanol restores stress-affected sleep in mice by alleviating stress18

Figure 3A三组数据：

文章6：The effect of Neuroligin-2 absence on sleep architecture and electroencephalographic activity in mice19Figure 2B三组数据

文章7：Sparse Activity of Hippocampal Adult-Born Neurons during REM Sleep Is Necessary for Memory Consolidation20Figure 3E四组数据

文章8：Red light at intensities above 10lx alters sleep–wake behavior in mice21Figure 2 abc三组数据和Figure 4a这些文章中的NREM episode number以及Wake episode number也存在均值与误差棒几乎一致的情况。

三、关于Figure 2C 中两列cumulative REM rebound 数据在连续时间点保持固定差值的问题（#7）

有评论指出，Figure 2C 中两只动物在连续多个时间点之间保持了固定的10.5 min 差值。这里同样存在对数据结构的误解。Figure 2C 展示的是cumulative REM rebound，即小鼠在睡眠剥夺后REM相较于剥夺前对应时间点差值的累计值，而不是每一个时间点相互独立的测量值。

在这样的计算方式下，只要两只动物在某一时间段内新增的REM rebound相同，或者这两只动物在睡眠剥夺前后的该时段完全没有REM发生，两条累计曲线此前已经存在的差值就会自然保持不变。特别是，质疑图中标注出的时间段是小鼠活动的高峰期，即使是正常小鼠该时间段REM睡眠也有为0的情况。再加上，Camk2a敲除鼠本身就有REM睡眠缺陷，被质疑的“连续六个时间点都差10.5分钟”的两只敲除小鼠，有四个时间点在剥夺前后没有REM睡眠，有两个时间点差值恰好一样（图8）。这在文章中检测的25只小鼠中并非是一个小概率事件。

图8 标绿的数据即是被质疑的数据点。

四、关于Supplementary Figure S1A 和S1B 中WT 数据完全相同的问题（#9）

Figure S1A和S1B 使用的是同一批WT C57BL/6J 小鼠（n=6）。WT、Camk2a+/−、Camk2a−/−、Camk2b+/−和Camk2b−/−小鼠在同一实验周期内完成Morris water maze 测试。作图时，为了分别展示Camk2a 和Camk2b mutant 的结果，我们将同一套实验数据分为两个panel，并将这批WT 小鼠作为共同对照。因此，S1A 和S1B 中WT 的individual escape latency data 应完全相同。

回顾这一实验设计，针对两个独立knockout line 分别使用各自的littermate WT controls 会是更加严格的设计，可以更充分地控制遗传背景和繁育环境等潜在差异。但是，这一设计局限与本评论所称的“duplicate data”是两个不同问题：两个panel 中WT 数据相同，是因为它们在设计时使用了同一批WT，而不是将一组独立实验的数据复制到了另一组实验中。

以上是回应的具体内容。需要表明的是，由于本文主要面向大众，对科学内容的表述可能存在因为科普目的而省略细节和特例的情况。如果读者还有没有解决的疑惑或者对睡眠领域感到好奇，可以阅读相关书籍和文献。同样的，我们也非常欢迎同行重复我们的实验，希望能够从科学角度出发，讨论Camk2b敲除小鼠的睡眠表型这一数量性状是否会受到不同实验室的记录环境差异的影响，这比较有趣，也会对睡眠领域做出贡献。

最后，祝大家有一个好的睡眠！