饶毅：有些人为什么早睡早起？饶议科学
为了好奇的研究：有些人为什么早睡早起？
以生物化学为发现途径，以遗传学为功能证据，研究生物钟。
我长期教课的一章是生物钟，但这是我实验室第一篇研究生物钟的研究论文
我实验室的研究，多数是一两个人为主的，文章也就经常作者不多，甚至有时就一个研究生和我。我自己做研究生期间也是这样。但有时例外。今天简介的工作作者多，因为前赴后继用了很长时间，虽然每一个阶段是一个研究生为主。
2001年，旧金山加州大学（UCSF）的Fu和Ptacek实验室在分析人的时候，发现有一家人，凡是出现特定突变的，其昼夜节律（“生物钟）不是二十四小时，而且缩短，所以他们每晚7点睡觉、早上4点起床（“提前相位综合症”）。具体突变在Per2基因，改变它编码的一个氨基酸，让662位的S（丝氨酸）变成G（甘氨酸）：S662G。
我们2012年开始找Per S662位点的激酶，到我们做完实验的2024年、发表文章的2026年距离发现现象的2001年是25年、距离我们开始这项工作是14年。
我们一开始没有特异抗体，那时读研究生的余腾辉试着用cDNA共表达筛选，找到磷酸化其他位点的激酶。然后通过北生所知道那个兔单抗的公司，一次就做成了抗S662磷酸化位点的特异抗体（在体外包括细胞可以，在体内不行），足以用于生化纯化的检测我们拿到CK1d和e，以及TSSK。
而在2018年，国外实验室发PNAS，他们发现（没有用生化提纯）CK1D和E磷酸化per 2 的S662。快而脏的研究（quick and dirty），但得到的结论一样（but made the point）。我们因此无法发表。
下面一个研究生李扬拼命做tssk的功能，但确实是它们却是睾丸特异的基因，不参与全身的生物钟，睾丸有没有生物钟？我们做不出来。失败了。
然后我们想救这文章，就在视上核（SCN）局部敲除 CK1，结果表型是生物钟减慢，与预期相反。
其他人后来也发表型，也是生物钟周期延长。这要是在那篇PNAS，就明显矛盾而无法发PNAS。
刘玉祥发现HEK细胞就有CK1之外的其他磷酸化PER2-662的蛋白激酶。
我们刘玉祥用生物化学分离纯化，找到磷酸化PER2-662位点的蛋白激酶MARKs。
它有四个类似的激酶（1-4）。一个一个MARK在D15培养细胞敲除，MARK2和3有生物钟表型而且是提前。好像MARK1没有、MARK4或者没有或者有
然后，在小鼠做基因剔除，MARK2肯定有生物钟表型，而且是提前，与S662突变的预计一样生物钟表型一样。
所以写文章了。
从2012年到2024年断断续续做实验，文章到2026才出来。
从好奇心上解决了困扰同领域科学家们的好奇。
但是，但只是部分，在这篇文章之后，可能还有工作。
哺乳动物生物钟蛋白PER2的生理性激酶MARK2的生物化学发现和功能研究
刘玉祥* 李扬* 余腾辉* 王涛 崔云凤 朱晨 贾晓波 李成钢 沈雨欣 王准 刘尚辰 黄娟 饶毅
遗传学一直是研究生物钟的重要方法，揭示了第一个生物钟的关键调控基因Period(Per)。2001年发现人类PER2基因第662 位点的丝氨酸突变成甘氨酸(S662G)会导致家族性睡眠状态提前综合征(FASP)，表现为活动起始时间提前和生物钟周期缩短。本研究发现，PER2 S662被CK1δ/ε、TSSK1/2及SIK1-3磷酸化，但分别敲除上述7个基因后均未观察到活动起始时间提前的表型。
进一步通过生化纯化实验发现，MARK2磷酸化S662位点，结合并稳定PER2蛋白。在Mark2缺陷型细胞中，细胞节律周期以S662位点依赖性的方式缩短。神经元特异性敲除Mark2基因的小鼠表现出活动起始时间提前和周期缩短。本研究揭示了MARK2作为生物钟重要调控因子的生理功能，同时证实了生化纯化方法在行为机制研究中的有效性。
生物钟，PER2，S662磷酸化，FASP，生化纯化，MARK2
生物钟调节生理和行为的日常节律，其紊乱与睡眠障碍等多种健康问题密切相关。PERIOD2 (PER2) 是生物钟的核心调控因子。2001年研究发现，人类PER2基因中第662位丝氨酸残基突变为甘氨酸(S662G)会引起家族性睡眠状态提前综合征(FASP)，表现为活动起始时间提前和周期缩短。该突变消除了S662的磷酸化修饰，而S662的磷酸化通常作为分子开关，稳定PER2并延长生物钟周期。过去25年间，寻找并鉴定磷酸化S662的激酶一直是该领域的研究热点。本研究通过生化纯化技术，首次确定MARK2（一种AMPK相关激酶家族成员）是PER2 S662的新激酶。
对所有21种AMPK相关激酶的进一步检测发现，其中部分成员可磷酸化PER2 S662。MARK2能够直接磷酸化PER2，与之结合，并通过S662磷酸化延缓其降解。在细胞中敲除MARK2基因导致细胞节律缩短，且该表型依赖于PER2 S662的磷酸化。神经元特异性敲除Mark2基因的小鼠表现出活动起始时间提前和周期缩短。本研究不仅证明了MARK2参与调控生物钟，也强调了生化方法在解决生理学难题中的有效性，并提示AMPK相关激酶可能通过调节PER2及其他蛋白的磷酸化参与生物钟调控。
生物钟对基本生理功能至关重要，其异常与健康状况密切相关。每年有超过十亿人次的跨时区旅行者和约20%的西方工作者从事轮班工作¹，与生物钟紊乱相关的健康问题日益受到关注²⁻⁷。
生物钟是一个内在的计时系统，驱动着睡眠/觉醒周期、免疫反应和新陈代谢等多个系统的日常节律⁸⁻¹⁰。在哺乳动物中，主时钟位于下丘脑的视交叉上核(SCN)，负责协调全身细胞的生物钟振荡¹¹‚¹²。50余年前，借助遗传学方法在果蝇¹³、脉孢菌¹⁴和衣藻¹⁵中发现影响生物钟的基因突变，使人类对生物钟分子机制的理解取得了重大突破。此后，在多种生物（尤其是果蝇和小鼠）中的遗传学研究，确立了相互连锁的转录-翻译反馈环(TTFL)作为生物钟的分子机制¹⁶⁻²⁴。
第一个被发现从果蝇到人类均保守的关键基因是Period(Per)¹³。哺乳动物中存在两个转录-翻译反馈环：在第一个TTFL中，转录因子BMAL1和CLOCK形成异源二聚体，激活3个Per基因和2个Cry基因的转录；随后，翻译产生的PER蛋白与其他蛋白形成大分子复合物，反馈抑制自身转录¹⁹‚²⁵⁻³⁶。第二个TTFL涉及BMAL1和CLOCK激活两个核受体基因(Rorα/β，Rev-erbα)，而翻译产生的RORα/β和REV-ERBα蛋白则反馈调节Bmal1的转录³⁷。近期，张二荃实验室发现核苷三磷酸酶(NTPase)也是保守的生物钟调控因子³⁸。
在核心生物钟调控蛋白中，PER家族成员在蛋白丰度上表现出最显著的节律振荡³⁹⁻⁴¹。合成后，PER2蛋白经历多位点逐步磷酸化，以调节其稳定性、抑制子活性和亚细胞定位³³‚³⁴‚³⁶‚⁴¹⁻⁴⁶。有两个磷酸化区域对PER2蛋白稳定至关重要：S478/482 phosphodegron（小鼠），其磷酸化后招募E3泛素连接酶β-TrCP，促进PER2降解，从而加速生物钟周期；FASP区域（从小鼠S659或人S662起始），由五个丝氨酸组成(SxxSxxSxxSxxS)，其磷酸化可抑制phosphodegron的磷酸化，从而稳定PER2并延长生物钟周期³³‚⁴¹⁻⁴⁴‚⁴⁷⁻⁵⁶。S662的磷酸化是FASP区域内后续磷酸化的先导事件⁴¹‚⁵¹‚⁵⁷⁻⁵⁹。人类S662G突变消除了这一先导磷酸化，阻断了后续FASP位点的磷酸化⁴¹‚⁴⁸‚⁵¹‚⁶⁰，导致家族性睡眠状态提前综合征，生物钟周期缩短约4小时。后续研究在转基因小鼠中成功重现了这一表型⁴³‚⁴⁸。
2001年的一项研究通过对一个家族的遗传学分析，发现人类PER2蛋白(hPER2)第662位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为甘氨酸(Gly)与家族性睡眠状态提前综合征(FASPS)相关⁴³‚⁶¹。hPER2 S662是酪蛋白激酶1δ (CK1δ)的先导磷酸化位点⁴³‚⁵¹‚⁵⁷‚⁵⁸。CK1δ和CK1ε被认为是PER2磷酸化的关键激酶，至少磷酸化小鼠PER2三个区域：phosphodegron(S478)、FASP先导磷酸化位点(S659)及FASP区域内的下游丝氨酸³³‚⁵⁰‚⁵¹‚⁶²‚⁶³。CK1δ/ε与PER2形成稳定复合物，通过其激活环的构象变化及C末端尾部磷酸化状态的改变来切换底物偏好，使PER2蛋白稳定性呈现开关样变化³³‚³⁴‚³⁶‚⁵⁶⁻⁵⁹‚⁶⁴。然而，在HEK293细胞中同时敲除CK1δ和CK1ε后，S662磷酸化水平显著降低但未完全消除，提示存在其他作用于该位点的激酶。
在长达15年寻找PER2 S662上游激酶的过程中，我们尝试了分子生物学和生物化学两种方法。在获得特异性识别hPER2磷酸化S662的抗体之前，我们将人类激酶组中的蛋白激酶cDNA与hPER2共转染，发现了几种能够磷酸化hPER2片段的激酶。在获得PER2 S662磷酸化单克隆抗体(mAb) 后，我们确认了CK1 δ和ε、TSSK1和2磷酸化PER2 S662位点。在所有CK1中，只有CK1δ和ε，而非CK1γ1、2或3，能在体外磷酸化S662。在D15细胞系中敲除CK1 δ和ε后，细胞节律周期延迟。第二种策略是使用抗磷酸化S662-PER2抗体进行生化纯化，这使我们发现了MARK2、3是PER2 S662的激酶。
它们属于AMPK相关激酶家族(ARK) 的成员⁶⁵-⁷⁷。我们比较了所有ARK激酶家族的体外活性，发现SIK 1-3、MARK 1-4、TSSK1和2磷酸化PER2 S662位点，其中MARK2和MARK3活性最强。敲除SIKs 未显示活动起始时间提前的表型⁷⁸-⁸⁰。TSSK1和2敲除小鼠（包括它们的双敲除），也未发现活动起始时间提前的表型。因此，CK1s、SIKs和TSSKs敲除小鼠的生物钟表型与人类FASPS患者⁴⁸ 或 PER2 S662G 突变小鼠⁴³ 在体内的表型不一致。
在D15细胞中过表达MARK2或3延长了细胞节律，敲除MARK2（而非MARK3）则缩短了节律，这与S662G突变的表型相似，进一步生化和遗传学证据证明MARK2在分子和生理上都位于PER2 S662的上游。在小鼠神经元敲除MARK2 导致活动起始时间提前和生物钟缩短，而MARK3敲除、MARK3神经元特异性敲除和MARK4神经元特异性敲除小鼠未表现出生物钟异常。因此，我们长期寻找PER2 S662激酶的努力揭示了MARK2是一个在生物钟调控中具有生理意义的激酶。
CK1 δ和ε磷酸化hPER2 S662与生物钟表型
早期研究曾报道CK1δ/ε可磷酸化PER2⁴¹,⁴⁸,⁶²,⁸¹，2005年被认为是PER2 S662的激酶⁴⁶，同一研究团队因未能在体外反应体系中检测到PER2 19氨基酸残基肽段中S662的直接磷酸化，推翻此观点⁴³。这一争议直至2018年才由Narasimamurthy等人解决，他们证实了CK1δ/ε可直接磷酸化PER2 S662位点⁵¹。近年结构和生化研究阐明了其调控PER2磷酸化的分子机制：CK1激活环的构象转换控制其对PER2的底物选择性，进而调控PER2的磷酸化位点，调控PER2稳定性开关；PER2 FASP区域的磷酸化可别构抑制CK1活性，确保生物钟周期的精确控制⁵³‚⁵⁴‚⁵⁶⁻⁵⁹。
在获得识别PER2 662位磷酸化的特异性抗体前，我们采用Phos-tag技术，通过SDS-PAGE检测磷酸化引起的凝胶迁移⁸²，筛选了包含288种人源激酶的cDNA文库（表S1），检测其对6个hPER2片段的磷酸化能力。将激酶cDNA与hPER2片段在HEK293T细胞中共转染后，发现数种可磷酸化特定PER2区域的激酶：PER2 1-200未被任何筛选激酶磷酸化；CDK5磷酸化PER2 150-400；PRKACB、PRKG1和IKKβ磷酸化PER2 328-556；CK1δ/ε、TSSK2和IKKε磷酸化PER2 556-771。
为明确CK1δ/ε是否磷酸化hPER2 S662，我们获得了特异性识别磷酸化S662 hPER2的单克隆抗体。该抗体特异性识别磷酸化的野生型人/小鼠PER2，但不识别S662A/S662D（hPER2）或S659A/S659D（mPER2）突变体（图S1A-C）。磷酸酶处理可消除其识别信号（图S1A-C）。
利用此抗体，我们证实了CK1δ/ε在细胞中磷酸化hPER2 S662位点（图S1D-H）。FLAG标记的CK1δ（图S1D）或CK1ε（图S1E）在HEK293细胞中磷酸化hPER2 556-771片段的S662。梯度转染CK1δ或CK1ε质粒可增加hPER2 S662位点的磷酸化水平（图S1G）。对其他CK1家族成员（CK1α1，α2，γ1，γ2，γ3）的检测显示，无论是将其共转染至HEK细胞（图S1F），还是采用免疫沉淀的CK1蛋白与重组hPER2片段进行体外激酶测定（图S1H），均未发现这些CK1可磷酸化PER2 S662。
